MUESTRA:Orina de 24 hs.recogida sobre 30 ml de tolueno. Se debe ver la capa de emulsión en la parte superior (menos en orinas de baja densidad). Realizar el regimen previo de tres días. TECNICA:1.) 0.5 ml de orina + 1.5 ml de HCl 67%Tapar y llevar a ebullición 3 hs. en autoclave a 124 grados. Se puede guardar la muestra hidrolizada en heladera. 2.) Agregar 2 ml de agua destilada y centrifugar. 3.) 1 ml de sobrenadante + 1 gota de fenolftaleína + 0.25 ml de KOH concentrado + gotas gotas de KOH diluído hasta viraje del indicador. El testigo vira con una gota de KOH diluído ( No agregar KOH concentrado). Prerarar HCL diluído para llegar a pH (Debe quedar color rosado). Testigo: 1 ml de agua destilada + 10 ul de testigo madre. 4.) Agregar :1.25 g de CLK. 0.5 ml de buffer borato. Agitar y controlar pH 8 . 0.25 ml de solución de alanina. (preparar en el día) 0.5 ml de cloramina T . Agitar . (preparar en el día). Esperar 20’ y agregar: 1.5 ml de tiosulfato de sodio. Agitar. 2.5 ml de tolueno. Agitar 100 veces. Se pueden guardar en la heladera los tubos tapados. 5.) Eliminar con trompa de agua la capa de tolueno superior ( sin sacar capa acuosa). 6.) Poner a hervir 30’ a baño maría aflojando los tapones. 7.) Enfriar en baño de hielo. Agregar 2.5 ml de tolueno, agitar 5’ . Dejar reposar. 8.) 0.62 ml de fase toluenica + 0.25 ml de reactivo de Erlich (previamente calentado a 37º) Hacer un blanco con tolueno. 9.) Dejar 15’ y leer a 560 nm. 10.) CALCULOS: OHprolina (mg/24hs.) = f x A desc. x diuresis
REACTIVOS:TESTIGO: Solución madre : 50 mg % en HCL 4 %Solución hija : (Se prepara en el día): 0.5 mg% (Madre diluída 1/100 con agua dest.) REACTIVO DE ERLICH: I ) 4.0 g de p-dimetilaminobenzaldehido + 6.7 ml de alcohol absoluto. II ) 0.913 ml de H2SO4 concentrado + 6.7 ml de alcohol absoluto. Verter II sobre I . Disolver en estufa a 37 ºC o en baño suave. enfriar. Se conserva algun tiempo. CLORAMINA T: (Se prepara en el día) 0.2M : 0.14 g de cloramina T + 2.5 ml de metilcellosolve BUFFER BORATO: (Ph 8.7) En un matraz aforado colocar un poco de agua destilada. Agregar 61.84 g de ácido bórico y 226 g de ClK. Disolver en 800 ml de agua destilada. Mezclar bien . Ajustar a pH 8.7 co NaOH 10 N y llevar a 1000 ml con agua destilada. TIOSULFATO DE SODIO: 3.6 M . Tiosulfato de Na.5H2O: 89.3 g , agua destilada csp. 100 ml. guardar en heladera. ALANINA: 10 g de alanina en 90 ml de agua destilada. Ajustar a pH 8.7 con KOH 10N y llevar a 100 ml con agua destilada. ( dura 15 días). De uso: 2 ml de solución anterior + 18 ml de agua destilada. Preparar en el día. Alternativa: 100 mg de alanina + 6 ml de agua destilada, ajustar a pH 8.7 co KOH y llevar a 10 ml con agua destilada. HCl 67 % : 67 ml de HCl + 33 ml de agua destilada. Guardar a Tº ambiente. FENOLFTALEINA 1 % : 1 g en 100 ml de alcohol. Guardar en heladera. KOH: 56 g csp 100 ml de agua destilada. Guardar en heladera. El diluído es 1/10
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